K599 Electroporation-Competent Cell 發根(電擊)感受態細胞

基因型：

Agrobacterium rhizogenes (strR ) pRi2659 (agropine type)

簡要說明：

發根農桿菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)農桿菌屬(agrobacterium)的一種革蘭氏陰性土壤細菌，它能夠感染大多數雙子葉植物和少數單子葉植物以及個別裸子植物。K599發根農桿菌（NCPPB2659）含有pRi2659農桿堿型Ri質粒，具有廣泛的宿主范圍（葫蘆科，豆科，茄科等），同時具有lian霉素抗性。 K599電轉感受態細胞經特殊工藝制作，pCAMBIA2301質粒（ka那霉素抗性）檢測，轉化效率>103 cfu/μg DNA

操作說明：

一： 0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發，待乙醇揮發干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。

二： 取-80℃保存的農桿菌感受態插入冰中5分鐘，待其融化，加入0.01-1 μg質粒DNA（體積不大于6ul，最好用試劑盒抽提，雙蒸水溶解；轉化效率較高，第一次使用前最好做預實驗確定所加質粒的量），用手bo打管底混勻，立即插入冰中，用200μl槍頭將感受態-質粒混合物快速移到電擊杯中，蓋上杯蓋，空管保留待用。

三：啟動電轉儀，設置參數：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此參數為Biorad 推薦，使用者也可按所用電轉儀推薦的protocol操作），將電擊杯從冰中拿出，吸水紙吸干外表面水份，快速放入電轉槽中，啟動電擊，電擊完成快速插入冰中，加入1 ml無抗生素的TY，并轉移到感受態空管中，28℃振蕩培養2~3小時。

四： 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的TY平板上，倒置放于28℃培養箱培養2-3天。

注意事項：

一：加入質粒時體積不應大于感受態體積的1/10；質粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉化效率急劇下降；質粒增大一倍，轉化效率下降一個數量級。

二： 電轉感受態細胞中不可混入氣泡，轉化高濃度的質粒可相應減少最終用于涂板的菌量。

三：平板上陽性克隆密度過大時，由于營養不足，陽性克隆生長變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應減少質粒用量或最終用于涂板的菌量。

四：K599具有lain霉素抗性，不可用于具有lian霉素抗性質粒的轉化。

備注：

1、農桿菌相關抗生素配方：

2、常用農桿菌抗性：（R：抗；S：敏感。）

3、TY配方（1L）：

Tryptone 5gYeast extract 3g補水到1L體積，wan全溶解后，121度、20分鐘高溫滅菌配制1M的氯化鈣水溶液，121度、20分鐘高溫滅菌每1L 滅菌的TY液體營養液中加入10ml 無菌的1M氯化鈣水溶液即可。若配制TY固體培養基，則加入15g 瓊脂粉。