基因型

Δ(araleu)7697ΔlacX74phoAPvuIIphoRaraD139ahpCgalEgalKrpsL(DE3)F[lac+lacIqpro]gor522::Tn10 trxB pLysSRARE2(CamR,StrR , TetR )

簡(jiǎn)要說明

Rosetta-gami(DE3)pLysS 菌株聚合了不同原核表達(dá)菌株的優(yōu)勢(shì)：Rosetta-gami賦予其Rosetta和Origami的優(yōu)點(diǎn)——補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的6 種稀有密碼子(AUA，AGG，AGA，CUA，CCC， GGA) 對(duì)應(yīng)的tRNA，提高外源基因的表達(dá)水平，并且包含突變的硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase）(trxB)和gu胱甘肽還原酶(glutathione reductase)(gor)基因，表達(dá)主要還原途徑的兩個(gè)關(guān)鍵酶。有利于形成正確折疊的含有二硫鍵的蛋白，增強(qiáng)蛋白的可溶性。該菌株染色體整合了λ噬菌體DE3區(qū)（DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA聚合酶），適合T7啟動(dòng)子誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)。該菌株攜帶的pLysS質(zhì)粒含有表達(dá)T7 yu菌酶的基因，能夠降低目的基因的背景表達(dá)水平，但不干擾IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)，適合表達(dá)毒性蛋白和非毒性蛋白。Rosetta-gami(DE3)pLysS菌株具有ka那霉素，lu霉素，lian霉素，四環(huán)素抗性，經(jīng)pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率高達(dá)107cfu/μg。

操作說明

1、取100μl冰上融化的 Rosetta-gami(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞，加入目的質(zhì)粒并輕輕混勻，冰上靜置25分鐘。

2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。 

3.向離心管中加入700μl不含抗生素的無菌2YT或LB培養(yǎng)基，混勻后37℃，200rpm復(fù)蘇60分鐘。

4.5000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含34 µg/ml lu霉素及所選質(zhì)粒篩選抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。

5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)

1、感受態(tài)細(xì)胞最好在冰上融化。

2.混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作。

3.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。

4.誘導(dǎo)時(shí)，IPTG濃度可選（0.1-2mM均可）。

5.為獲得需要量的蛋白，最佳誘導(dǎo)時(shí)間，溫度，IPTG濃度需實(shí)驗(yàn)者優(yōu)化。 

6.菌株攜帶 pLysS質(zhì)粒，除復(fù)蘇培養(yǎng)基為無抗生素外，其余所用培養(yǎng)基、培養(yǎng)液均應(yīng)含有34 µg/ml lu霉素，以防質(zhì)粒丟失。

7.具有ka那霉素抗性，不能用于具有ka那霉素抗性質(zhì)粒的表達(dá)。